O projeto HIDROGENOMA

O Microbismo das Águas Minerais Naturais

As motivações

Portugal é muito rico em águas minerais naturais (AMN), devido à sua diversidade geológica.DiversidadeAMN A composição destas águas tem suscitado, ao longo dos anos, o interesse de especialistas das mais diversas áreas científicas. No entanto, estes estudos centraram-se sobretudo na caracterização físico-química das águas.

Do ponto de vista químico, predominam as águas sulfúreas, que são caracterizadas por possuírem pH elevado (normalmente acima de 8,3) e pela presença do ião flúor, de formas reduzidas de enxofre e também pelo elevado teor em sílica. Algumas destas águas minerais possuem temperatura superior a 40C.

O controlo microbiológico destas águas, à boca da captação, é apenas direcionado para a pesquisa de certos patogénicos:

  •  Parasitas e microrganismos patogénicos (às 48h/37C e às 72h/22C);
  •  Coliformes e estreptococos fecais;
  •  Escherichia coli;
  •  Anaeróbios esporulados sulfito-redutores;
  • Pseudomonas aeruginosa.

TermalismoNo caso das AMN, cuja temperatura de emergência é superior a 60C (p.e Chaves, Vizela, Aregos e São Pedro do Sul), acredita-se que os microrganismos existentes sejam outros que não os pesquisados de acordo com a Legislação atualmente em vigor.Engarrafamento

Por outro lado, no caso das águas engarrafadas, a data de validade do produto engarrafado é meramente indicativa, pois não existe nenhum estudo que revele o “envelhecimento” da água mineral natural. Torna-se fundamental o conhecimento mais profundo das AMN, com particularidades tão únicas. Devemos conhecer estas águas como “um todo”, não apenas como resultado da interação água-rocha, que obviamente contribui para as valências terapêuticas destas, mas também como resultado da respetiva composição ao nível do microbismo natural.

Contrariando alguns pressupostos do passado, os sistemas hídricos subterrâneos são, cada vez mais, vistos como ecossistemas. Os recentes avanços no domínio da microbiologia, em particular no que se refere à microbiologia molecular, têm revelado a presença de populações microbianas em condições adversas de temperatura, pH e Eh.

microbismo

O avanço no desenvolvimento de técnicas e ferramentas moleculares tem tornado possível a ampliação do potencial do estudo da biodiversidade microbiana e inferir sobre a geoquímica de compostos. Estas técnicas, uma vez otimizadas, permitem a geração de informações importantes sobre a estrutura e dinâmica de comunidades microbianas e das suas relações com a rocha/água.

Projeto-Piloto

O ponto de partida

Em 2010 a Direção-Geral de Energia e Geologia (DGEG) foi promotora de um estudo multidisciplinar sobre as águas minerais naturais utilizadas no termalismo, englobando as vertentes da hidrogeologia, microbiologia e geoquímica, no fundo, um estudo “hidrobiogeoquímico”. Foi contactado o Instituto Nacional de Investigação Agrária e Veterinária, I.P. (INIAV) para a realização de análises de DNA às águas minerais naturais, previamente selecionadas pela DGEG.

AMNprojeto

metodologiaA metodologia:

  1. Identificação das águas minerais naturais utilizadas em termalismo;
  2. Caracterização destas águas consoante a geologia, o tipo hidrogeoquímico e a temperatura de ocorrência, de forma a agrupar estas águas por “grupos tipo”;
  3. Seleção de 10 águas minerais naturais;
  4. Colheita de amostras destas águas, à boca da captação, para realização de análises microbiológicas;
  5. Realização de análises metagenómicas;
  6. Estudo das relações existentes entre características geológicas, microbiológicas e hidrogeoquímicas.
Recolha_amostras

Para cada água mineral natural contemplada no estudo foi efetuado um resumo, que contém uma breve descrição dos microrganismos encontrados e a análise filogenética. Estas análises correspondem à determinação do DNA presente nas amostras recolhidas, o que implica não haver distinção entre os microrganismos vivos e os mortos. Essa distinção é feita ao nível da determinação do RNA. A DGEG reuniu estes primeiros resultados, sendo que alguns detes foram muito surpreendentes e reveladores da riqueza das nossas águas minerais ao nível da composição microbiológica. A título de exemplo, revelou-se que algumas águas possuem bactérias que têm:Resultados

  • Capacidade antibiótica;
  • Agem contra a doença do cancro da mama;
  • Propriedades anti-stress, entre outras.

Estes primeiros dados referem-se a todos os microrganismos existentes nas amostras estudadas, quer estejam vivos ou mortos. É de extrema importância determinar também o RNA, para se saber quais os que estão vivos, e fundamentalmente, quais as “conversas” entre si, que nos dão informação sobre o meio onde se inserem.

Os fatores chave

Alguns dos fatores que levaram a DGEG a implementar este projeto foram: a Inovação, o Termalismo, a Saúde, o Turismo, o Desenvolvimento Regional, a Cosmética e a Geotermia.

Fatores

 

Inovação

O projeto inclui estudos e ensaios experimentais que assentam em metodologias de biologia molecular e bioinformática recentes - a Metagenómica e Transcriptómica. Portugal será pioneiro neste estudo que contempla a caracterização do microbismo natural de todas as águas minerais naturais de Portugal Continental, numa dupla vertente: no aumento do conhecimento dos circuitos de circulação subterrâneos das águas minerais naturais e na valorização da exploração sustentada destas águas.

Termalismo

O desenvolvimento deste estudo contribuirá fortemente para a credibilização do termalismo português. Até à data, as valências terapêuticas das águas minerais naturais foram definidas de uma forma empírica ou estabelecidas de acordo com o quimismo destas águas. Pretende-se que cada água mineral natural utilizada nas Termas tenha a sua própria assinatura, o seu “código de barras”. Desta forma, o utente poderá deslocar-se a determinada estância termal tendo em conta as indicações terapêuticas que procura, cientificamente definidas.

Saúde

O setor do termalismo é conhecido, desde há séculos, como um meio de cura de determinadas enfermidades e ao comprovar cientificamente as razões desses tratamentos, perspetiva-se que o termalismo poderá ser considerado um meio de tratamento eficaz, contribuindo para a diminuição do recurso a produtos farmacêuticos, da ocupação de camas nos hospitais e dos custos dos tratamentos clássicos, promovendo a saúde e o bem-estar de todos aqueles que possam frequentar os estabelecimentos termais portugueses.

Turismo

O Termalismo pode ser um fator estratégico de desenvolvimento económico nacional, devido ao potencial hidrológico de Portugal, quer pela diversidade de tipos de água, quer pela ampla distribuição geográfica, quer ainda pelo número de estâncias termais existentes no país, razões suficientes para se apostar no setor. Esta aposta é uma oportunidade cativante para atrair mais turistas e fará ainda mais sentido, quando demonstradas as indicações terapêuticas das águas minerais naturais, quer do ponto de vista químico, quer do ponto de vista biológico.

Desenvolvimento regional

Esta abordagem estratégica para o desenvolvimento sustentado das águas minerais naturais, permitirá impulsionar o termalismo português como produto para o desenvolvimento socioeconómico de certas regiões do interior do país. O crescimento do setor turístico associado ao termalismo, o aparecimento de novas valências e de “experiências sensoriais”, incluindo atividades de lazer e cuidados de bem-estar, beleza e estética, consideram-se, neste contexto, como oportunidades de negócio e de investimento.

Cosmética

O desenvolvimento de produtos dermacosméticos (p.e biogeleias) com fins medicinais, a partir de águas termais está em crescente expansão. O conhecimento do microbismo natural das águas minerais naturais portuguesas poderá permitir a deteção e isolamento de determinados microrganismos capazes de produzir compostos de interesse com propriedades benéficas e relevantes para este tipo de produtos dermatológicos, cosméticos ou mesmo farmacêuticos.

Geotermia

O estudo metagenómico destas águas possibilitará obter informação mais detalhada sobre pressões e temperaturas existentes no reservatório, contribuindo para um maior conhecimento do circuito de circulação destas águas. Desta forma, torna-se possível determinar a que profundidade e temperatura estas águas circularam, permitindo inferir se será possível captar águas com temperaturas elevadas que perspetivem a produção de energia elétrica, ou seja, a existência de recursos de alta entalpia em profundidade.

Projeto Pioneiro

O Hidrogenoma

Hidrogenoma_azul

Face aos resultados obtidos até à data, surge assim o Projeto Hidrogenoma - Uma Nova Visão Estratégica para as Águas Minerais Naturais, um estudo inovador sobre o microbismo natural destes recursos hidrogeológicos, liderado pela DGEG e cofinanciado pelo POSEUR (Projeto POSEUR-03-2215-FC-000001), com duração de dois anos e meio, no qual foram incluídas cerca de oitenta (80) Águas Minerais Naturais (AMN) existentes em Portugal continental, usadas em termalismo, engarrafamento e geotermia.

O propósito de alcançar um conhecimento mais detalhado sobre estas AMN, conduziu ao estudo do metagenoma destas, de modo a englobar as vertentes da hidrogeologia, da microbiologia e da geoquímica, numa perspetiva multidisciplinar.

Este tipo de metodologia permitirá, através do material genético presente nestas águas, caracterizar as respetivas comunidades microbianas existentes nestes ambientes, recorrendo a técnicas de biologia molecular que permitem obter informação sobre a biodiversidade existente e a distribuição dos microrganismos comumente e excecionalmente encontrados nestes recursos hidrogeológicos, bem como identificar determinados microrganismos com material genético e metabolismo com interesse biotecnológico. Desta forma, com base científica, será possível compreender qual o papel das comunidades microbianas nestes recursos geológicos e qual o seu impacto na preservação da saúde do Homem, de acordo com o tipo de aproveitamento das mesmas.

Para manter a sustentabilidade dos recursos hidrominerais como ecossistemas únicos e inimitáveis, o conhecimento, a caracterização e a preservação das comunidades microbianas autóctones, que constituem o microbismo natural de cada água mineral e a sua correlação com os efeitos benéficos para a saúde, são fatores de fundamental importância para melhor conhecer o recurso e consequentemente otimizar a exploração do mesmo.

Trata-se de um projeto pioneiro, não só pela dimensão e importância da amostragem, pela originalidade do método na medida em que é estudado sem exemplos ou modelos antecedentes o genoma destas águas, como também pelo objetivo ambicioso de se tentar conhecer todas as AMN do país com maior detalhe.

Os Objetivos

O objetivo principal consistiu no conhecimento do microbismo natural das AMN, com a identificação da composição taxonómica da microbiota presente nestas águas, através da metagenómica por Sequenciação de Nova Geração (NGS). Com esta abordagem, apresentam-se os microrganismos existentes nas AMN por comparação entre as amostras recolhidas, determinando a biodiversidade microbiana, os grupos taxonómicos representativos destas comunidades microbianas, assim como os microrganismos viáveis isolados e caracterizados em laboratório. Numa fase posterior, pretende-se investigar a partir destas populações o respetivo habitat e a relação de filogenia entre estas, por forma a aprofundar o conhecimento geológico dos sistemas aquíferos e dos ambientes naturais onde se localizam.

Este estudo envolve essencialmente uma componente de geologia e outra de biologia, numa perspetiva multidisciplinar que aproxima, de forma complementar, ambas as áreas. Na componente da geologia iniciaram-se os estudos para demonstrar a interação entre rocha-água-microrganismos, para desenvolver uma primeira hipótese de correlação entre a dinâmica dos microrganismos identificados com o quimismo das AMN e o meio geológico envolvente. Neste âmbito, foi efetuado o enquadramento hidrogeológico para cada uma das águas estudadas, incluindo a descrição do modelo conceptual do sistema aquífero, bem como a respetiva utilização atualmente em contrato, o perímetro de proteção e a caracterização físico‑química da água.

Na componente da biologia estudou-se o microbismo natural das águas selecionadas, através da identificação por metagenómica dos respetivos microrganismos existentes, de modo a associar os resultados obtidos com as características físico-químicas das águas. Foi quantificada a biodiversidade microbiana, através do cálculo do índice de diversidade de Shannon-Wiener, e demonstrada a distribuição comparativa dos microrganismos por grupo taxonómico que compõem as comunidades microbianas presentes nas amostras, tendo em vista o propósito de relacionar o microbismo natural com as respetivas indicações terapêuticas, através do estudo dos transcriptomas.

Posteriormente, por pesquisa bibliográfica, foi reunida informação sobre a atividade metabólica indicativa das espécies mais representativas identificadas no bacteroma destas águas, de modo a obter informação adicional sobre as possíveis funcionalidades destas populações microbianas no meio onde se inserem, que precisa ser validada e complementada com estudos adicionais. A caracterização edafoclimática da área envolvente de cada AMN foi também efetuada para avaliar as condições do meio envolvente que possam interferir com a captação destas águas.

A metodologia do estudo

A metodologia usada consistiu num conjunto variado de trabalhos, efetuados ao longo de cerca de dois anos e meio, delineados para a caracterização do microbismo.

--- Colheita de amostras ---

Efetuaram-se quatro (4) fases de colheita de amostras para cada uma das AMN estudadas – F1, F3, F5 e F7 – e quatro (4) fases de análise genómica subsequentes – F2, F4, F6 e F8 – para cada uma dessas amostras, de modo a reunir quatro (4) etapas de resultados para cada água, perfazendo um total de oito (8) fases organizadas em quatro (4) parcelares distintos, com a seguinte sequência:

  • 1º parcelar, F1-F2;
  • 2º parcelar, F3-F4;
  • 3º parcelar, F5-F6; e
  • 4º parcelar, F7‑F8.
Fases_metodologia

Em cada uma das fases de colheita, as amostras das AMN foram recolhidas, à boca da captação, abrangendo duas épocas do ano distintas ‑ primavera e outono - durante os anos hidrogeológicos de 2017 e 2018. A colheita de amostras foi realizada, de acordo com as indicações estabelecidas pela DGEG, para as quais foi feito o enquadramento biofísico e a caracterização edafoclimática, acompanhados pela avaliação das condições em que as mesmas se encontravam, à medida que os trabalhos decorriam.

--- Controlo de qualidade de amostras ---

Todas as amostras recolhidas foram sujeitas a um controlo de qualidade, através da quantificação dos parâmetros legais estabelecidos pelo Decreto-Lei n.º 156/98, de 6 de junho, e pela Portaria n.º 1220/2000, de 29 de dezembro. Neste procedimento foi realizada a contagem do número de colónias viáveis, posteriormente isoladas e caracterizadas, de acordo com morfologia e características bioquímicas. Por fim, foram identificados os microrganismos viáveis provenientes destas águas, organizados em grupos com particularidades semelhantes e validados por sequenciação de Sanger.

--- Análise metagenómica ---

Posteriormente, a análise metagenómica foi efetuada nas amostras que passaram no controlo de qualidade. Esta técnica analisa as sequências de DNA extraídas diretamente das amostras de AMN recolhidas do ambiente sem necessidade de cultivo, abrangendo as comunidades microbianas a partir do seu habitat natural e permitindo estabelecer hipóteses sobre interações do microbismo com o próprio ambiente. Antes do início das análises genómicas, foi quantificado e analisado qualitativamente o DNA extraído, avaliando estatisticamente o efeito das variáveis - quimismo, temperatura de emergência e pH - e de que forma se podem correlacionar com o rendimento do material genético obtido a partir da amostragem.

De seguida, foram preparadas as bibliotecas de sequências metagenómicas de DNA, utilizando a metodologia amplicon sequencing, que permite amplificar fragmentos de interesse com marcadores moleculares fluorescentes que marcam os nucleótidos e, dessa forma, possibilitam o estudo da biodiversidade microbiana e da estrutura populacional. Nesta etapa foram produzidas bibliotecas específicas por grupo de microrganismos a estudar. Os genomas das águas em estudo foram assim sequenciados, usando um sequenciador massivo, Miseq/Ilumina, que integra uma plataforma de Sequenciação de Nova Geração (NGS), caracterizada por promover o aumento exponencial da quantidade de informação biológica gerada.

metodo

As sequências produzidas foram analisadas, recorrendo a software de bioinformática, processando automaticamente as sequências de metagenomas e comparando com as sequências armazenadas em bases de dados genéticos e bibliotecas metagenómicas públicas, determinando assim as afiliações taxonómicas possíveis com a informação disponível, a análise da diversidade e a estrutura dos hidrogenomas respetivos. Desta forma, com o tratamento de resultados gerados por NGS foram identificados os organismos presentes nas AMN em estudo, revelando a composição do hidrogenoma por amostra, validada por análise comparativa dos resultados provenientes das várias fases do estudo (F2, F4, F6 e F8).

Para cada uma das amostras são apresentados os resultados de afiliação taxonómica, através da percentagem de leituras (reads) validadas, evidenciando as diferenças de assignação, de acordo com as características das águas minerais naturais, nomeadamente, o quimismo, a temperatura de emergência, o pH e local envolvente. Como expectável, a afiliação ao nível de espécie aumenta com o número de amostras.

Tendo em conta de que se trata de um estudo pioneiro, ao nível da abrangência e local da amostragem, o sucesso da afiliação ao nível da espécie depende da existência de informação compatível com a das bases de dados existentes (GenBank), que disponibilizam publicamente sequências de nucleótidos de mais de 250 mil espécies. Contudo, frequentemente não se obtém assignação para alguns dos microrganismos sequenciados, uma vez que, as sequências que os caracteriza não foram ainda estudadas e depositadas nestas bases. Consequentemente, a microbiota das AMN sem assignação taxonómica são novos contributos para o aumento do conhecimento nesta área e para a introdução de novas espécies de bactérias à ciência, que podem levar à descoberta de novos genes funcionais. Por sua vez, a determinação da afiliação ao nível da espécie para as águas incluídas neste estudo, obtendo as que são exclusivas de cada uma das AMN, é um dos desafios do projeto Hidrogenoma na definição do Código Hidrobiómico das mesmas.

Pela primeira vez, foi também efetuado o estudo de transcriptomas, através da extração do RNA das amostras de AMN recolhidas, para comprovar algumas das indicações terapêuticas com base nos dados das atividades biológicas indicativas dos genes expressos (ORFs), para os quais se obteve maior número de cópias e cujos transcritos estão registados. Foram estudados quatro (4) transcriptomas correspondentes a uma AMN de cada tipo: bicarbonatada, sulfúrea, gasocarbónica e hipossalina.

--- Resultados ---

O contexto ambiental das amostras influencia o comportamento das comunidades microbianas, afetando a respetiva diversidade e abundância relativa. Os resultados obtidos demonstram que a composição do microbismo das AMN varia com o tipo de água.

De uma forma geral, as águas hipossalinas revelam características mais transversais, que exercem menor pressão seletiva sobre as populações microbianas, visível pelo número elevado de espécies obtido, sem destaque na comunidade global. As águas sulfúreas possuem uma composição mais complexa, associada a compostos de enxofre, proporcionando maior seleção dos microrganismos que a compõem, destacando‑se espécies quimiolitotróficas, aptas a oxidar compostos inorgânicos para obtenção de energia. Por sua vez, as águas bicarbonatadas reúnem particularidades de ambas as águas descritas anteriormente, nas quais os microrganismos com capacidade de converter elementos de enxofre têm também presença significativa. Nas águas gasocarbónicas, as espécies de bactérias com maior ponderação distinguem-se das restantes águas, tendo uma distribuição uniforme de vários grupos que demonstram adaptação a condições variáveis. Por último, as águas cloretadas reúnem microrganismos resistentes a radiação, assim como outros relacionados com a metabolização do enxofre.

--- Caracterização das Águas Minerais Naturais ---

No âmbito deste projeto foi elaborada, para cada uma das AMN estudadas, uma ficha de caracterização individual, específica para a respetiva captação selecionada para o estudo, que contempla as características gerais do recurso hidromineral, o seu enquadramento geológico e, sempre que possível, o respetivo modelo conceptual do sistema aquífero. São igualmente apresentados os resultados do hidrogenoma de cada uma destas águas obtidos, com a caracterização preliminar do respetivo microbismo natural. Esta caracterização pode ser consultada nesta plataforma, pesquisando por água (nome, número cadastro, distrito, freguesia).

Na caracterização geológica pode-se encontrar a localização da concessão hidromineral (adaptada da carta geológica à escala 1:1.000.000 e à 1:50.000), uma breve descrição do contexto geológico ao nível das principais unidades geológicas e tectónica e as características gerais do recurso, onde se inclui o tipo de utilização –  termalismo, engarrafamento e geotermia –, a caracterização da água com base nos dados da última análise físico-química completa realizada à captação e a referência à portaria que fixou o perímetro de proteção. Por fim, é apresentada uma descrição ao nível da hidrogeologia, com uma apresentação resumida do sistema aquífero e do modelo conceptual do mesmo, quando possível.

A caracterização do microbismo natural engloba a apresentação das comunidades microbianas por grupo taxonómico – Classe, Género e Espécie – que caracterizam o hidrogenoma de cada uma das AMN. A descrição das espécies predominantes inclui uma breve referência, com base em pesquisa bibliográfica, da atividade metabólica indicativa desses mesmos microrganismos, acompanhada com alguns dados relevantes de análises físico-químicas da mesma época das colheitas do projeto, para melhor correlacionar estas características com o tipo de água e comunidades bacterianas identificadas. Para cada uma das amostras das diferentes fases do estudo, é também indicada a diversidade de espécies, determinada através do índice de Shannon‑Wiener e o número de espécies identificadas. Os microrganismos viáveis são enumerados nas fichas, assinalando aqueles que não têm classificação e que correspondem a novas espécies, por não serem ainda conhecidos e não existirem registos nas bases de dados consultadas.

Uma das ambições deste projeto consistiu em determinar a assinatura hidrobiómica de cada AMN, com a identificação das espécies exclusivas com assignação taxonómica conhecida. No entanto, nem todas as águas apresentam um hidrogenoma consolidado, ou seja, sem variação significativa da diversidade genética na respetiva amostragem. Para as águas sem o hidrogenoma consolidado, devem ser analisadas mais amostras para a respetiva validação do microbismo natural como representativo da AMN.

Perspetivas futuras

O projeto Hidrogenoma proporcionou inúmeros resultados e novos contributos relevantes no âmbito das águas minerais naturais e das competências da Direção-Geral de Energia e Geologia nesta área, como entidade reguladora destes recursos hidrominerais. Esta plataforma digital e iterativa tem como objetivo divulgar os dados obtidos entre especialistas, concessionários e o público em geral, para potenciar a utilização destes recursos de forma mais consistente e eficaz, bem como promover a realização de estudos subsequentes que complementem este primeiro grande passo na história destas águas.

Resultados

A caracterização do microbismo natural das AMN sujeitas a este estudo, revela uma associação entre o microbismo  e as principais características deste tipo de água, sendo também indicadores das respetivas utilizações e propósitos atuais, dos setores de atividade existentes e dos possíveis benefícios para a saúde atualmente reconhecidos. O primeiro objetivo de caracterização microbiológica foi concluído, no entanto, pretende-se debruçar mais especificamente sobre cada uma das águas, no sentido de analisar individualmente o microbismo identificado com as características geológicas e, posteriormente, identificar as indicações terapêuticas relacionadas.

Por um lado, foram identificadas AMN com hidrogenomas consolidados, para as quais é importante continuar com os estudos dos transcriptomas, adaptados às condições laboratoriais que cada AMN exige, agora conhecidas, de modo a obter resultados reprodutíveis. Por outro lado, em todas as AMN em que a diversidade genética do bacteroma é significativa é aconselhável o seguimento desta análise para confirmar a estabilidade do respetivo hidrogenoma e determinar quais as variáveis que podem estar a contribuir para a variabilidade observada.

A DGEG está totalmente disponível para direcionar, acompanhar e colaborar com os concessionários na análise e interpretação destes resultados obtidos, bem como desenvolver os mesmos, de acordo com os interesses, da realidade e do contexto de cada exploração e setor de atividade, tendo em conta a experiência adquirida.